以下是 Transgenomics(IDT) 突變檢測(cè)試劑盒的正確操作規(guī)程
2025-09-22 234
以下是 Transgenomics(IDT) 突變檢測(cè)試劑盒的正確操作規(guī)程：
1.前期準(zhǔn)備
-樣本采集與處理
根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的樣本類(lèi)型，如血液、組織等。按照說(shuō)明書(shū)要求對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，包括裂解細(xì)胞、提取核酸等步驟，以獲得高質(zhì)量的 DNA 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。確保提取過(guò)程中避免引入雜質(zhì)和抑制劑，以免影響后續(xù)反應(yīng)的準(zhǔn)確性。
-儀器校準(zhǔn)與檢查
確保所使用的儀器設(shè)備處于正常工作狀態(tài)。提前預(yù)熱 PCR 儀至適宜溫度，并檢查其程序設(shè)置是否符合試劑盒的要求。同時(shí)，準(zhǔn)備好干凈的微量移液器及配套槍頭，保證移液精度。
-試劑解凍與混勻
從 -20℃取出試劑盒后，讓其緩慢升溫至室溫。輕輕顛倒幾次使各組分充分混合均勻，但不要?jiǎng)×艺鹗?，防止產(chǎn)生氣泡或破壞酶活性。特別注意含有酶類(lèi)的試劑，應(yīng)在冰上操作以保持其穩(wěn)定性。
2.Transgenomics(IDT) 突變檢測(cè)試劑盒PCR 擴(kuò)增階段
-配制反應(yīng)體系
嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的比例取適量的主混合物，其中已包含除模板 DNA 外的所有必要成分。然后加入經(jīng)純化的模板 DNA，加無(wú)菌水補(bǔ)足至總體積到規(guī)定值。使用微量移液器準(zhǔn)確吸取各組分，每更換一種試劑最好更換一次槍頭，避免交叉污染。
-加樣與離心
將配制好的反應(yīng)液小心地加入到 PCR 管或板中。加樣完成后，輕輕混勻樣品并短暫離心，使液體集中于管底，確保反應(yīng)體系中各成分分布均勻。
-設(shè)置 PCR 程序
根據(jù)目標(biāo)基因序列的長(zhǎng)度和 GC 含量等因素，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)建議設(shè)置熱循環(huán)儀的參數(shù)，包括變性溫度、退火溫度及延伸時(shí)間等。例如，一般變性溫度可設(shè)為 94 - 95℃，退火溫度根據(jù)引物的 Tm 值確定，通常低于引物 Tm 值 5℃左右，延伸時(shí)間則依據(jù)片段長(zhǎng)度調(diào)整。啟動(dòng) PCR 儀開(kāi)始擴(kuò)增反應(yīng)。
3.酶切分析階段
-準(zhǔn)備酶切反應(yīng)體系
PCR 擴(kuò)增完成后，取一定量的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)。按照試劑盒提供的說(shuō)明，加入適量的 SURVEYOR 酶和其他必要的緩沖液組件，構(gòu)建酶切反應(yīng)體系。注意控制好反應(yīng)體系的體積和各成分的比例。
-孵育與消化
將配好的酶切反應(yīng)體系在合適的溫度下孵育一定時(shí)間，讓 SURVEYOR 酶充分發(fā)揮作用，切割異源雙鏈 DNA 錯(cuò)配位點(diǎn)。孵育過(guò)程中保持恒溫環(huán)境，避免溫度波動(dòng)影響酶活性。
-終止反應(yīng)
到達(dá)預(yù)定的孵育時(shí)間后，采取適當(dāng)?shù)姆椒ńK止酶切反應(yīng)，如加熱失活酶或者加入終止緩沖液。這樣可以防止過(guò)度消化導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。
4.Transgenomics(IDT) 突變檢測(cè)試劑盒結(jié)果檢測(cè)與分析
-選擇合適的檢測(cè)平臺(tái)
該試劑盒支持多種檢測(cè)平臺(tái)，如標(biāo)準(zhǔn)膠電泳、熒光毛細(xì)電泳、LI - COR 等。可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有設(shè)備條件選擇合適的平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)。如果使用凝膠電泳，需制備合適濃度的瓊脂糖凝膠；若采用熒光檢測(cè)系統(tǒng)，則要確保儀器的性能良好且參數(shù)設(shè)置正確。
-上樣與檢測(cè)
將酶切產(chǎn)物小心地上樣到選定的檢測(cè)平臺(tái)上。對(duì)于凝膠電泳，要注意上樣量適中，避免過(guò)載影響條帶分辨率；在使用熒光檢測(cè)時(shí)，要保證樣品加載正確且無(wú)氣泡產(chǎn)生。然后運(yùn)行檢測(cè)程序，獲取數(shù)據(jù)。
-數(shù)據(jù)分析與解讀
根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。觀察切割片段大小能夠提示突變位點(diǎn)的位置，切割產(chǎn)物的數(shù)量能夠提示突變數(shù)是 1 個(gè)、2 個(gè)還是 3 個(gè)等。結(jié)合實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮皖A(yù)期結(jié)果，判斷是否存在突變以及突變的類(lèi)型和位置。同時(shí)，注意排除假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的可能性，可通過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)或其他驗(yàn)證方法來(lái)確認(rèn)結(jié)果的可靠性。
